【目的】构建中国油茶（Camellia oleifera）主要传粉昆虫之一的大分舌蜂(Colleles gigas)cDNA文库并利用全国几个典型样本筛选微卫星DNA(Simple sequence repeat，SSR)位点，为该蜂种群遗传多样性和遗传分化研究提供可靠的分子标记。【方法】使用10头大分舌蜂雌性幼虫构建cDNA文库，用Illumina Hiseq TM 2500高通量测序平台测定cDNA文库数据，通过SSR筛选软件MISA进行检索发掘SSR标记；利用Primer Premier 5.0软件设计引物，利用荧光标记技术进行分型。【结果】从cDNA文库序列中筛选得到16 457个SSR，其中15 563个(占比为94.57%)是完整型SSR，872个(占比为530%)是不完整型SSR，22个(占比为0.13%)是复合型SSR；完整型SSR中单碱基SSR最为丰富，共10 910个，占总SSR数量的70.11%，其余依次是二碱基SSR (2 099个，占比为13.49%)、三碱基SSR(2 408个，占比为15.47%)、四碱基SSR(136个，占比为0.87%)和五碱基SSR (10个，占比为0.06%)。对80对EST-SSR引物在6个不同地理种群32头大分舌蜂中进行验证，共有6对EST-SSR引物较好地扩增出目的片段，共获得192个等位基因，平均等位基因数为11.833 332个，平均有效等位基因数为4.149 8个，香农信息指数范围为1.362 6～2.119 2，平均观测杂合度为1.000，平均期望杂合度为0.800，多态信息含量范围为0.710～0.879，且平均值为0.761。【结论】研究所开发的6对大分舌蜂EST-SSR引物对应的产物多态性较高，遗传多样性也较高，可以应用于该蜂种的遗传多样性、遗传分化、种质资源保护等领域的后续研究。