【目的】明确大分舌蜂(Colletes gigas)巢穴病原微生物的种属及系统发育学特征。【方法】从江西省新余市采集大分舌蜂巢穴样品，采用稀释涂布平板法进行病原微生物分离，通过形态特征观察，结合核糖体内转录间隔区(Internal transcribed spacer，ITS)和16S rDNA基因序列分析相结合的方法对病原微生物进行鉴定。【结果】从虫室样品中分离出4株细菌(CS1，CS2，CS3和CS4)，从土壤样品中分离1株真菌(TR1)。TR1在电子显微镜下可见菌丝间有球状孢子囊，孢子呈现圆形，TR1的ITS序列与卷枝毛霉(Mucor circinelloides)的相似度为100%。CS1和CS3均能产生粉红色次生代谢物，CS1和CS3聚为一支，它们的16S rDNA序列与粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的相似度达到99%；CS2的16S rDNA 序列与少见无色杆菌(Achromobacter spanius)的相似度为99%；CS4的16S rDNA序列与紫金牛叶杆菌(Phyllobacterium myrsinacearum)的相似度为95%。【结论】从大分舌蜂巢穴虫室样品分离出的病原细菌分别属于沙雷氏菌属(Serratia)、无色杆菌属(Achromobacter)和叶杆菌属(Phyllobacterium)，从土壤样品分离出的病原真菌属于毛霉属(Mucor)。