【目的】调查乌江干流中下游鱼类资源状况并初步构建乌江流域鱼类DNA条形码数据库。【方法】以COI基因作为DNA条形码，通过条形码缝隙(Barcode gap)分析、ABGD(Automatic barcode gap discovery)分析和邻接(Neighbor-joining，NJ)树构建等方法对乌江干流647尾鱼类样本进行了分子鉴定。【结果】1) 通过形态学鉴定，共鉴定出鱼类3目8科35属47种，其中鲤形目(Cypriniformes)、鲇形目(Siluriformes)和鲈形目(Perciformes)的种类数分别占全部种类数的70.21%，19.15%和10.64%。2) 非单样本物种中仅蛇鮈(Saurogobio dabryi)与银鮈(Squalidus argentatus)间不存在条形码缝隙。3) NJ树分析结果显示47个物种均各自聚为1支，ABGD分析结果显示647尾鱼类样本可划分为49个OTU，与NJ树分析结果相近。4) DNA条形码分子鉴定结果与形态鉴定结果一致。【结论】DNA条形码在乌江鱼类中的鉴定成功率为97.22%；初步构建的乌江流域鱼类DNA条形码数据库为乌江流域鱼类生物多样性保护提供了一定的科学依据和数据支持。